Relevância Fisiológica das proteínas ORF7a e Spike do SARS-CoV-2 na inibição de Teterina/ BST2

Sumário Executivo da Proposta

O SARS-CoV-2, agente etiológico da COVID-19, é um novo membro do gênero β Coronaviridae que surgiu em Wuhan, China, no ano de 2019 e se espalhou pelo mundo, caracterizando um cenário de pandemia e ocasionando centenas de milhares de mortes. A infecção pelo SARS-CoV-2 desencadeia um quadro de insuficiência respiratória grave, similar ao desencadeado pela infecção com o SARS-CoV, com quem compartilha 80 % de homologia. O novo coronavírus é um vírus envelopado formado por RNA de fita simples de senso positivo com 30kb. Seu genoma codifica quatro proteínas estruturais, spike (S), envelope (E),membrana (M), e nucleocapsídeo (N); ademais, apresenta 16 proteínas não estruturais e 6 proteínas acessórias relacionadas com a replicação e virulência (ORF3a, ORF6, ORF7a, ORF7b ORF8 and ORF9).
A resposta imune inata é a primeira linha de defesa antiviral e essencial à imunidade contra infecções virais. No caso de vírus RNA, como o SARS-CoV-2, o material genético pode ser recohecido pelos seus padrões moleculares associados a patógenos (PMAPs) [7]. Tal reconhecimento é feito pelas famílias de receptores celulares Toll-like (TLR), desencadeando cascatas de sinalização que culminam com a produção de intereferon I e III e citocinas inflamatórias como TNF-α IL-1, IL-6 e IL-18. O interferon tipo I (IFN I) é o principal imunoregulador em infecções virais [8], podendo agir de forma autócrina ou parácrina, promovendo o bloqueio da replicação e disseminação viral, induzindo a expressão de fatores celulares antivirais e/ou impedindo o sequestro do maquinário celular pelo vírus [9].
Uma importante proteína antiviral induzida por IFN I é a proteína BST2 (bone marrow stromal cell antigen 2), homodimérica de e 30 kDa constituída por cerca de 180 aa; também é conhecida como teterina e CD317.Trata-se de uma proteína transmembrana de tipo II formada por uma pequena cauda N-terminal citoplasmática (CT), uma região transmembrana (TM), um ectodomínio (ED) e uma segunda âncora C-terminal glicosilfosfatidilinositol (GPI), além disso apresenta dois possíveis sítios de glicosilação. A deleção TM ou GPI torna a BST2 não funcional.
A proteína BST2 impede a liberação de vírus envelopados. Tal função foi demonstrada primeiramente nas infecções por vírus da imunodeficiência humana tipo I (HIV-1) e posteriormente do sarcoma de Kaposi (KSHV), Lassa, Marburg vírus Ebola vírus, dengue vírus (DENV) e coronavírus como SARS-Cov e HcoV-229E. Estudos conduzidos com HIV-1 sugerem que BST2 pode ter atividade de sensor viral, ativando a expressão de genes pró-inflamatórios dependentes de NFκB. Entretanto, a proteína BST2 também induz a degradação autofágica da proteína mitocondrial de sinalização antiviral (MAVS), promovendo a interação entre MAVS e NDP52 e a degradação de MAVS por autofagossoma. Como MAVS faz parte da cascata de síntese de IFN I, a degradação de MAVS promovida por BST2 configura um mecanismo de feedback negativo.
Todavia, diversos vírus desenvolveram estratégias com intuito de evadir os mecanismos celulares de defesa. O SARS-CoV expressa uma série de proteínas antagonistas diretas ou indiretas da ação antiviral do IFN I. Dentre as proteínas do SARS-CoV antagonistas de IFN I encontram-se: papain-like protease (PLPro- nsp3), ORF6, nsp1, ORF3b e ORF7a. As quatro primeiras apresentam atividade antagonista de IFN I, sendo que PLPro inibe IRF3 e ativação de NFκB; ORF3b também bloqueia IRF3; ORF6 impede a translocação de STAT1 para o núcleo e nsp1 bloqueia a expressão de IFNßpela degradação de mRNA. Já a ORF7a exerce seu mecanismo inibitório bloqueando a glicosilação de BST2, o que resulta em inibição de sua atividade antiviral. Por outro lado, quando super expressa, a ORF7a mostrou induzir apoptose por via das caspases e bloqueio do ciclo celular na fase G0/G1.
Recentemente foi observado que o SARS-Cov-2 apresenta maior susceptibilidade a IFN I em comparação ao seu antecessor, SARS-Cov. Lokugamage e colaboradores constataram que a presença de IFN I aumentava a fosforilação e expressão de STAT1 e proteínas antivirais como TRIM25. A partir da análise comparativa dos genomas virais, foram observadas duas diferenças em relação a expressão de proteínas antagonistas de interferon: a ORF3b não está presente no SARS-CoV-2, enquanto que a ORF6, presente no SARS-CoV-2, apresenta 69% de identidade em relação ao seu antecessor. Essas evidências foram apontadas como principais responsáveis pela diferença de sensibilidade ao IFN I [4]. No entanto, ainda não foram realizados estudos funcionais com a proteína ORF7a, a qual apresenta identidade de 85,25% entre ambos os vírus (Figura 1). Curiosamente, o sequenciamento de um isolado do estado do Arizona, USA, evidenciou uma deleção de 81 pb na região ORF7a do SARS-CoV-2, que resultou em uma deleção de 27 aminoácidos [26].
Por outro lado, recentemente foi observado que a glicoproteína S do SARS-CoV diminui o efeito inibitório mediado por BST2 [27]. De acordo com o estudo, tal observação resulta da capacidade da proteína S de promover a degradação de BST2 pela via lisossomal, similar a via de degradação promovida pela proteína Vpu do HIV-1. Desde que a glicoproteína S do SARS-CoV e do SARS-CoV-2 apresentam identidade de 76%, se torna prioritário o estudo das possíveis diferenças na capacidade inibitória da proteína BST2 e consequentemente na sensibilidade à IFN (Figura 2).
Neste contexto, considerando o importante papel que as proteínas ORF7a e S do SARS-CoV no bloqueio do fator celular antiviral BST2, propomos por meio deste projeto determinar a relevância fisiológica da ORF7a e da proteína S do novo coronavírus em relação a ação antiviral da proteína BST2. Esperamos que o desenvolvimento deste projeto nos permita trazer informações relevantes que auxiliem no entendimento dos mecanismos envolvidos maior susceptibilidade do SARS-CoV-2 ao IFN I e na identificação de novos alvos terapêuticos.