Informações
Nível de aprovação pela UnB
Aprovado pela UnB
Nome Completo do Proponente
IZABELA MARQUES DOURADO BASTOS CHARNEAU
Matrícula UnB
1010859
Unidade acadêmica da UnB
dourado@unb.br
Link Cúrriculo Lattes
Título da Proposta
Prospecção de moléculas inibitórias das proteases quimiotripsina-like protease (MPro) and papaína‐like protease (PLPro), com atividade antiviral contra o Sars-Cov2
Sumário Executivo da Proposta
Essa proposta tem como foco a prospecção de moléculas capazes de inibir as proteases virais quimiotripsina-like protease (MPro) and papaína‐like protease (PLPro) do Sars-Cov2, causador da atual pandemia COVID-19. Essas proteases, exclusivas dos coronavírus, são essenciais para o vírus estabelecer seu ciclo, e portanto representam potenciais alvos terapêuticos com menor chance de efeitos colaterais. Propomos testar 1) cerca de 3000 moléculas de origem natural da biblioteca de compostos do Museu Nacional de História Natural de Paris (MNHN) (Andrade et al.), 2) compostos naturais como óleos essenciais e suas moléculas majoritárias, 3) moléculas sintéticas do nosso banco, sendo a maioria contra proteases (de Almeida et al., 2016) 4) inibidores de proteinase do tipo Bowman-Birk Inhibitor (BBI). As moléculas mais ativas serão testadas in vitro para determinar a sua atividade anti-Sars-Cov2 em células pulmonares humanas CALU-3 (Zhang et al., 2020). Pretendemos contribuir com a nossa vasta experiência em proteases de patógenos inclusive virais (DENV e ZIKV) e estudo de seus inibidores, nos esforços para uma resposta rápida de combate ao COVID-19.
Palavras-chave
Isabela da Cunha Costa Cardoso
Número de Integrantes da Equipe
11
Nome dos Integrantes da UnB
Izabela Marques Dourado Bastos Charneau, Jaime Martins de Santana, Milene Aparecida Andrade, Philippe Grellier, Sébastien Olivier Charneau, Carla Nunes de Araújo, Clênia dos Santos Azevedo, Isabela da Cunha Costa Cardoso, Amanda Couto Tambellini, Marta do Nascimento Barbosa, Osmindo Rodrigues Pires Júnior, Mariana de Souza Castro
Há integrantes externos à UnB?
Sim
Possui apoio de Grupo de Pesquisa Certificado pela UnB no CNPq?
Sim
Nome/Link do Grupo de Pesquisa certificado no CNPq pela UnB
Laboratório de Interação Patógeno-Hospedeiro
Público alvo
Análise do Contexto
As particularidades da infecção por COVID-19, tais como alto índice de contágio, transmissão por vias aéreas, grande período de internação dependente de respiradores, aliados a globalização, indicam para o grande impacto sem precedentes no colapso dos sistemas de saúde e na economia mundial. Esse cenário de “guerra” impôs a necessidade iminente no desenvolvimento de kits diagnósticos, vacinas e medicamentos. Como não há terapêutica direcionada e as opções de tratamento eficazes permanecem muito limitadas, o foco dessa proposta é a prospecção de moléculas antivirais inibidoras das proteases do vírus Sars-Cov2, agente causador da COVID-19.
Os coronavírus são vírus de RNA de fita positiva que apresentam os maiores genomas de RNA viral conhecidos até o momento (27 a 31 kb). No caso do coronavírus humano, grande parte desse genoma é composto pelo gene da replicase que codifica duas poliproteínas sobrepostas pp1a e pp1ab que medeiam todas as funções necessárias para replicação e transcrição viral (Chen et al., 2020). Cerca de dois terços do genoma viral codifica 16 polipeptídeos, as nsp1 a 16 que são processados pelas proteases virais quimiotripsina-like protease ou main protease (MPro) e papaina-like protease (PLPro). O outro terço do genoma, localizado mais na porção 3’, codifica as proteínas estruturais spike (S), de membrane (M), do envelope (E) e do nucleocapsídeo (N). Os polipeptídeos funcionais são liberados das poliproteínas por extenso processamento proteolítico (Hilgenfeld, 2014). O Mpro (3CLpro) cliva a poliproteína em pelo menos de 11 locais conservados envolvendo as seqüências de Leu-Gln ↓ (Ser, Ala, Gly), um processo iniciado pela própria clivagem autolítica da enzima das pp1a e pp1ab (Ziebuhr et al., 2000; Masters, 2006). As poliproteínas SARS-CoV têm três locais de clivagem Mpro não-canônicos com Phe, Met ou Val na posição P2, mas os mesmos locais de clivagem também são incomuns em outros coronavírus (Hilgenfeld, 2014).
Os primeiros estudos produzidos e publicados em meio a crise, demonstram o potencial dessas proteases como alvo terapêuticos. Em um deles usando como estratégia o reposicionamento de fármacos, uma estratégia eficaz de descoberta de medicamentos que pode reduzir o tempo e o custo. Nesse estudo, baseado em análise filogenética e rede de proximidades, foram priorizados 16 drogas (Zhou et al., 2020), com duas delas direcionadas a PLpro, a melatonina e mercaptopurina, sendo essa última demonstrada experimentalmente em um estudo prévio como seletivo para SARS-COV (Chen et al., 2020).
O outro estudo apresenta a estrutura cristalográfica da Mpro conjugada com um inibidor α-cetoamida, previamente projetado, mas com a ligação amida P3-P2 incorporada em um anel de piridona para aumentar a meia-vida do composto no plasma (Zhang et al., 2020). Esse inibidor modificado foi capaz de inibir a replicação viral in vitro e sua caracterização farmacocinética, in vivo, revelou um tropismo pulmonar pronunciado e adequação para administração pela via inalatória.
Breve Fundamentação Teórica
A importância proteases Mpro e PLpro para o processamento proteolítico, que é essencial para o ciclo de vida viral, torna esta proteinase um alvo evidente para o desenvolvimento de medicamentos direcionados contra infecções por coronavírus. Outro argumento é que não são conhecidas proteases humanas com uma especificidade de clivagem semelhante, tornando improvável que os inibidores sejam tóxicos (Anand et al., 2003; Jin et al., 2020). Com potencial antiviral destacam-se moléculas de origem natural e seus derivados como, por exemplo, piranonaftoquinonas, isômeros do lapachol, possuem atividade antiviral para DENV-2 atuando sobre a atividade da ATPase/NS3 (Da Costa et al., 2013) e Inibidores de proteinase do tipo Bowman-Birk Inhibitor (BBI). Numa triagem de 3000 moléculas da biblioteca do MNHN-Paris, identificamos 25 moléculas ativas contra NS3/protease/ZIKV (Andrade et al). Além disso, diversos óleos essenciais apresentam atividade antiviral (Ocazionez et al., 2010), sendo muitos comercializados, principalmente em países europeus, como fitoterápicos em diferentes formulações.
Objetivos e Metas
O objetivo geral dessa proposta de pesquisa é expressar e purificar as proteases quimiotripsina-like protease (MPro) and papain-like protease (PLpro), bem como realizar a prospecção de moléculas inibitórias (naturais e/ou sintéticas) para as referidas proteases e avaliar a atividade antiviral dos compostos com melhores atividade inibitórias.
Metas:
• Expressar e purificar as enzimas recombinantes;
• Determinar a atividade enzimática das enzimas recombinantes purificadas;
• Realizar a triagem dos compostos fornecidos pela biblioteca de compostos do MNHN e óleos essenciais pelos de ensaios de inibição enzimática;
• Determinar o valor da concentração capaz de inibir 50% da atividade enzimática (IC50) dos compostos mais promissores provenientes da etapa de triagem;
• Realizar a caracterização bioquímica dos melhores inibidores;
• Realizar ensaios antivirais dos compostos com melhores atividade inibitórias.
Metodologia
Expressão e purificação das enzimas recombinantes
Os genes serão sintetizados e clonados em vetor de expressão. As enzimas serão produzidas em E. coli BL21DE3 e purificadas com a resina HIS-Select® Nickel Affinity Gel conforme protocolo a ser padronizado.
Inibição enzimática das proteases
Para a atividade enzimática e a realização dos ensaios de inibição da Mpro será utilizado o ensaio de FRET, empregando o substrato MCA-AVLQ↓SGFR-Lys (Dnp)-Lys-NH2 e o substrato RLRGG-AMC para PLpro. Será determinado (IC50) e Ki paras inibidores mais potentes (Baez-Santos et al., 2014; Jin et al., 2020).
Teste antiviral in vitro
Os inibidores serão testados conforme protocolo estabelecido por Zhang et al., 2020.
Resultados Esperados
1. Obtenção das proteases MPro e PLpro do SARS-CoV-2 recombinantes e caracterização bioquímica das mesmas;
2. Identificação de ao 10 menos moléculas (naturais e/ou sintéticas) com atividades antivirais contra as proteases MPro e PLpro do SARS-CoV-2;
3. Integração entre pesquisa e serviço;
4. Obtenção de conhecimento científico a cerca dessas proteases com relação a mecanismo de ação e inibição.
5. Formação de recursos humanos e divulgação científica.
Área de Conhecimento
Subárea de Conhecimento
Há previsão de Orçamento proveniente na unidade acadêmica?
Sim
Valor da previsão de financiamento da unidade
R$70.000,00
Cronograma da Execução
Primeiro semestre: Expressar e purificar as enzimas recombinantes;
Primeiro e segundo semestre: Determinar a atividade enzimática das enzimas recombinantes purificadas;
Primeiro e segundo semestre:Realizar a triagem dos compostos fornecidos pela biblioteca de compostos do MNHN e óleos essenciais pelos de ensaios de inibição enzimática;
Segundo e terceiro semestre: Determinar o valor da concentração capaz de inibir 50% da atividade enzimática (IC50) dos compostos mais promissores provenientes da etapa de triagem;
Segundo e terceiro semestre: Realizar a caracterização bioquímica dos melhores inibidores;
Terceiro e quarto semestre: Realizar ensaios antivirais dos compostos com melhores atividade inibitórias.
Tempo total de execução previsto
24
