Informações
Nível de aprovação pela UnB
Aprovado pela UnB
Nome Completo do Proponente
Sonia Maria de Freitas
Matrícula UnB
136417
Unidade acadêmica da UnB
nina@unb.br
Link Cúrriculo Lattes
Título da Proposta
Prevenção da infecção viral dos SARS-CoV mediante inibição das serinoproteases transmembrana II humana (TMPRSS2) e 3CLpro por um inibidor de proteases Bowman-Birk e peptídeos derivados
Sumário Executivo da Proposta
Este projeto contempla uma abordagem teórico-experimental na expectativa de contribuir com a prevenção da infecção viral dos SARS-CoV, por meio do inibidor de proteases Bowman-Birk, denominado BTCI (do inglês Black-eyed-pea trypsin/chymotrypsin inhibitor, purificado de sementes de feijão de corda (Vigna unguiculata), bem como alguns de seus peptídeos derivados. Este inibidor tem sido estudado há mais de 40 anos pelo grupo de Biofísica Estrutural da UnB, tendo sido extensivamente caracterizado estruturalmente e funcionalmente. Três atividades importantes foram atribuídas a este inibidor: apresenta efeito anticarcinogênico contra câncer de mama em modelos de linhagens de células invasiva (MDA) e não invasivas (MCF7), mediado pela inibição do proteassoma 20S [1,2,3]; o BTCI é capaz de atravessar a membrana plasmática e co-localizar com o proteassoma 20S (na forma de complexo) no citoplasma e no núcleo das células MCF7; apresenta efeito natriurético aumentando a taxa de filtração glomerular e o fluxo de íons e potencia a ação do peptídeo guanilina, que apresenta efeito natriurético em sistema renal, em modelos de ratos Wistars [4]; apresenta efeito hipotensor, em modelos de ratos Wistar e SHR (naturalmente hipertensos), por administração venosa [5] e por gavagem [6], mediado pela atividade inibitória contra a enzima conversora de angiotensinogênio 1 (ECA1). Portanto, a presente proposta está embasada no potencial biotecnológico e biomédico deste inibidor, conforme apresentado, e nos estudos recentes do nosso grupo mostrando que o BTCI inibe a atividade enzimática de uma serinoprotease transmembrana II humana (TMPRSS2) (artigo em preparação) na superfície celular de várias células alvo que permite a ativação de proteínas S ligadas ao receptor AEC2 na superfície da célula hospedeira viral, induzindo a fusão da membrana plasmática do envelope viral e a entrada direta de SARS-CoV nas células. Ao mesmo tempo a proteína 3CLpro é do tipo quimotripsina-like, o que nos permite sugerir um caminho para a sua inibição.
No presente projeto propomos avaliar o efeito inibitório do inibidor de serinoproteases da família Bowman-Birk, denominado BTCI, e de seus peptídeos derivados, contra proteases como as serinoproteases transmembrana II humana (TMPRSS2) e a protease principal do SARS-CoV, denominada 3CLpro, essencial para a replicação do vírus. Para o desenvolvimento do projeto, abordaremos duas estratégias, uma teórica e outra experimental. Na parte teórica, propomos obter e analisar os complexos moleculares das serinoproteases citadas com o BTCI e peptídeos derivados, por simulação computacional de dinâmica molecular e métodos híbridos QM/MM (do inglês: quantum mechanics/molecular mechanics), docking molecular, bem como determinação da estrutura eletrônica dos átomos da interface dos complexos para avaliação do mecanismo de interação molecular. Experimentalmente, as serinoproteases serão obtidas por recombinação gênica, a partir do gene sintético, e testadas enzimaticamente, in vitro, utilizando métodos espectroscópicos e calorimetria de titulação isotérmica (ITC), sob a ação do BTCI e dos peptídeos derivados. Neste contexto, os parâmetros termodinâmicos e as constantes de ligação serão determinados para avaliação da afinidade e da estabilidade dos complexos formados. O efeito destes inibidores também será avaliado na presença da proteína S, a ser obtida por recombinação gênica, para, em conjunto com os resultados a serem obtidos com as outras proteases, constituírem dados que fundamentam o efeito preventivo do processo de infecção do SARS-CoV.
[1] Joanitti, G. A., Azevedo, R. B. & Freitas, S. M. Apoptosis and lysosome membrane permeabilization induction on breast cancer cells by an anticarcinogenic Bowman-Birk protease inhibitor from Vigna unguiculata seeds. Cancer letters 293, 73-81, doi:10.1016/j.canlet.2009.12.017 (2010).
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[4] Carvalho, A. F. et al. BTCI enhances guanylin-induced natriuresis and promotes renal glomerular and tubular effects. Brazilian journal of biology = Revista brasleira de biologia 68, 149-154 (2008).
[5] da Cunha Morales Alvares, A. et al. Bowman-Birk protease inhibitor from Vigna unguiculata seeds enhances the action of bradykinin-related peptides. Molecules (Basel, Switzerland) 19, 17536-17558, doi:10.3390/molecules191117536 (2014).
[6] Maria Alzira Garcia de Freitas, Nathalia Oda Amaral, Alice da Cunha Morales Álvares, Sandriele Aires de Oliveira, Azadeh Mehdad, Diego Elias Honda, Amanda Sá Martins Bessa, Marcelo Henrique Soller Ramada, Lara Marques Naves, Carolina Nobre Ribeiro Pontes, Carlos Henrique Castro, Gustavo Rodrigues Pedrino and Sonia Maria de Freitas. Blood pressure-lowering effects of a Bowman-Birk inhibitor and its derived peptides in normotensive and hypertensive rats. Scientific Reports (em análise “minor revision”). 2020.
Tipo da Proposta
Palavras-chave
Coronavirus, SARS-Cov, seriniproteases, inibidores de proteases, quimica computacional, inibidores Bowman-Birk, infecção viral
Número de Integrantes da Equipe
13
Nome dos Integrantes da UnB
Sonia Maria de Freitas (IB-UnB) - Proponente - Coordenadora, João Batista Lopes Martins (IQ-UnB), Érica Cristina Moreno Nascimento (IQ-UnB), João Alexandre Ribeiro Gonçalves Barbosa (IB-UnB), Aisel Valle Garay (IB-UnB), Napoleão Fonseca Valadares (IB-UnB), Gideane Mendes de Oliveira (Ms IB-UnB), Izadora Cristina Moreira de Oliveira (Ms IB-UnB), Jonathas Cunha Barbosa Lima, Diego Elias Honda (Ms-IQ-UnB), Julia Freitas de Vidal (Ms-IB-UnB)
Washington Almeida Pereira (Dout. IQ-UnB), Dois pós-doc (1 a definir), Amanda Araújo de Souza
Há integrantes externos à UnB?
Não
Possui apoio de Grupo de Pesquisa Certificado pela UnB no CNPq?
Sim
Nome/Link do Grupo de Pesquisa certificado no CNPq pela UnB
Público alvo
Comunidade Acadêmica | População em Geral | Profissionais da Saúde
Análise do Contexto
A nova pneumonia induzida por coronavírus 2019 (COVID-19) ou síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2) apareceu pela primeira vez em Wuhan, na China (dezembro de 2019) e rapidamente foi classificada pelo World Health Organization (WHO) como Emergência em Saúde Pública de Interesse Internacional (Janeiro, 2020) e como doença epidêmica pela OMS (fevereiro, 2020) [1]. O COVID-19 não é o primeiro surto grave respiratório causada pelos coronavírus, em duas décadas já aconteceram três epidemias: síndrome respiratória aguda grave de 2002-2003 (SARS-CoV), síndrome respiratória do Oriente Médio em 2012 (MERS-CoV) e atualmente o COVID-19 [2].
A entrada nas células hospedeiras é o primeiro passo no ciclo de vida do vírus e constitui um importante alvo para tratamento e prevenção. A entrada ocorre através da fusão da membrana viral do envelope com as membranas celulares alvos, por duas vias diferentes: (i) via fusão com a membrana citoplasmática ou (ii) via fusão com membranas endossômicas (Fig. 1) [3]. Os coronavírus codificam três proteínas de superfície na membrana do envelope: espiga (S), membrana (M) e envelope (E). As proteínas M e E desempenham um papel na montagem e liberação das partículas virais [4]. A proteína S se liga aos receptores das células hospedeiras e funde a membrana viral com a membrana celular para a entrada infecciosa [5,6]. A nível estrutural foi determinado o reconhecimento molecular entre as proteínas S do SARS-CoV e SARS-CoV-2 com a enzima conversora de angiotensina 2 (ECA2) como um receptor para entrar nas células [2,3,7,8] (Fig. 1).
Esse reconhecimento é a primeira etapa e um determinante significativo para à patogênese da infecção, particularmente para a alta taxa de infecção do SARS-CoV-2 [9,10]. Mas, as interações entre as proteínas S e ECA2 não são suficientes para a entrada nas células hospedeiras. Além disso, um evento crítico de ativação por clivagem proteolítica das proteínas S dos SARS-CoV é necessária para fusão das membranas viral e da célula alvo [11]. A ligação da proteína S a ECA2 desencadeia sutis alterações conformacionais na proteína S, que a tornam S suscetível à ativação pelas proteases das células hospedeiras, cuja localização tecido específica determina a infecção nas vias respiratórias [12].
Fig. 1 Mecanismos de penetração viral empregados pelos SARS-CoV para sua entrada nas células-hospedeiras.
As vias são determinadas pela localização das proteases necessárias para a ativação da proteína Spike (proteína S) de SARS-coronavírus. A ligação do coronavírus SARS ao receptor celular, ACE2 (ECA2), pode resultar na absorção de virions nos endossomos, onde a proteína spike é ativada pela protease principal (3CLpro). Alternativamente, nas células com proteases na membrana citoplasmática, a proteína spike pode ser ativada pela protease TMPRSS2 na superfície da célula, depois de sua ligação à receptor ACE2 (ECA2), resultando na fusão da membrana viral com a membrana plasmática. Figura tomada e modificada de [3].
Após a ativação, um peptídeo de fusão localizado no N-terminal da subunidade S2 da proteína S se insere na membrana plasmática ou uma membrana endossômica, alvo de acordo com a via de entrada (Fig. 1) [13]. Portanto, as atividades das proteases das células hospedeiras são essenciais para a ativação proteolítica da proteína S e a infectividade por SARS-CoV, de acordo com a entrada viral (Fig. 1).
A presença da serinoprotease transmembrana II humana (TMPRSS2) na superfície celular permite a ativação de proteínas S ligadas ao receptor AEC2 na superfície da célula hospedeira, induzindo a fusão da membrana plasmática do envelope e a entrada direta de SARS-CoV nas células (Fig. 1) [14-16]. Este mecanismo de ativação pela enzima TMPRSS2 foi descrito durante a entrada do vírus da influenza A como pré-requisito para a fusão entre membranas celulares virais e hospedeiras. A ativação da proteína hemaglutinina por clivagem proteolítica é crítica para a infecção viral onde a distribuição tecidual de proteases determina o tropismo celular das cepas de vírus pelos tecidos [17]. Na ausência de proteases na superfície celular, o SARS-CoV entra nas células por uma via endossômica e a proteína S é ativada para fusão por algumas das proteases endossomais do tipo tripsina, catepsina L ou elastase (Fig. 1) [18-24]. A replicação viral via entrada direta pela membrana citoplasmática demonstrou ser 100 vezes maior que a replicação pela via endossômica [16], sugerindo que a maior infectividade do SARS-CoV nos pulmões pode ser devida a um aumento da entrada direta dos vírus as células mediada pela protease TMPRSS2. Depois que o vírus entra nas células, o genoma do RNA viral é liberado no citoplasma e é traduzido em duas grandes poliproteínas por meio do deslocamento de quadro de leitura ribossômico [25]. Essas poliproteínas são clivadas e transformadas em proteínas não estruturais maduras (NSPs) pelas proteases virais 3CLpro principal (protease do tipo 3C) e a PLpro (papaína-like) (Fig. 1) [25,26].
Devido à atual situação epidemiológica e aos reiterados surtos de SARS-CoV, qualquer esforço destinado a encontrar novas moléculas que interfiram no bloqueio da infecção ou do seu desenvolvimento será importante. As estratégias de prevenção ou tratamento terapêutico de vírus baseadas na inibição de proteases são abordagem válidas e já foram desenvolvidos para vírus e muitas infecções parasitárias [27], que requerem ativação por proteases para entrada viral e replicação eficiente. Exemplos disto são os inibidores para os filovírus e os Ebolavírus que requerem da ação da catepsina B e catepsina L (proteases de cisteína), respectivamente para a entrada viral eficiente [28].
Diante desses fatos, a enzima de membrana TMPSS2, as proteases endossomais tripsina e elastase, e a protease viral principal 3CLpro são potenciais alvos terapêuticos da infecção pelos SARS-CoV. Neste contexto, propomos o estudo estrutural e enzimático do efeito inibitório de um inibidor de serinoproteases denominado BTCI e de seus peptídeos derivados, visando a prevenção do processo de infecção do SARS-CoV, conforme a estratégia apresentada na Fig, 1.
Vale ressaltar que, os grupos de pesquisa do Laboratório de Biofísica Molecular (Departamento de Biologia Celular - Instituto de Ciências Biológicas) e do Instituto de química da UnB, têm atuado extensivamente em projetos que visam a caracterização funcional deste inibidor de proteases, o BTCI, constituindo em estratégia para a procura de fármacos terapêuticos. Neste contexto, estes grupos têm avançado ou terminado as seguintes metas:
- a expressão heteróloga em Escherichia coli do domínio catalítico da enzima TMPRSS2 humana, sua purificação e caracterização estrutural e enzimática por técnicas espectroscópicas.
- predição da estrutura 3D modelagem molecular da TMPRSS2.
- procura das condições de cristalização da TMPRSS2.
- determinação do mecanismo de inibição não competitivo do BTCI sobre a enzima TMPRSS2.
- desenho, obtenção e caracterização da inibição de peptídeos derivados do BTCI contra serinoproteases.
- análise estrutural eletrônica dos átomos presentes na interface dos complexos entre o BTCI e as proteases tripsina e quimotripsina, por métodos computacionais semiempíricos. No entanto, muitas etapas ainda são necessárias para o entendimento do efeito inibitório do BTCI e seu envolvimento no processo de prevenção da infecção viral, mediante a ação inibitória contra as proteases envolvidas neste processo.
REFERENCIAS:
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[28] Leslie, M., Infectious diseases. Drug developers finally take aim at a neglected disease. Science 333 (2011), 933–935.
Breve Fundamentação Teórica
O surto da nova SARS (Severe acute respiratory syndrome) demanda uso de estratégias de química medicinal englobando simulações computacionais e ensaios in vitro, para gerar medicamentos antivirais. O coronavírus SARS-CoV-2 causa a doença respiratória denominada de COVID-19. Uma possível caminho para drogas antivirais para o COVID-19 está embasada nas proteases TMPRSS2, tripsina endossomal e a 3CLpro, essenciais para a replicação do vírus. A TMPRSS2 está envolvida na fusão vírus-células, as proteases 3CLpro (3C like protease) e a PLpro (papain like protease) estão envolvidas no processamento proteolítico das poliproteínas virais. A estrutura cristalográfica da proteína S e da protease principal do SARS-CoV-2 foram resolvidas recentemente, o que possibilitam os estudos de docking molecular para identificação de drogas ou inibidores ativos, derivados do BTCI e peptídicos derivados, conforme apresentado .
Objetivos e Metas
No presente projeto propomos, como estratégias antivirais direcionadas a essas proteases os seguintes objetivos e metas.
Objetivo geral:
Avaliar o efeito inibitório do inibidor Bowman-Birk, denominado BTCI, e seus peptídeos derivados, bem como os fármacos cloroquina, hidroxicloroquina, leflunomida, metotrexato e sulfasalazina contra as serinoproteases envolvidas no processo da penetração e replicação dos SARS-CoV (proteína transmembrana II humana (TMPRSS2) e 3CLpro), visando prevenir o processo de infecção viral.
Metas:
- Obtenção dos complexos moleculares das proteases TMPRSS2 e 3CLpro e os inibidores por simulação computacional usando técnicas de dinâmica molecular e métodos híbridos QM/MM e docking molecular, e avaliação da afinidade e estabilidade dos complexos;
- Síntese do gene e expressão e purificação das proteases TMPRSS2, 3CLpro e proteína S viral
- Obtenção e caracterização estrutural e enzimática dos complexos moleculares das proteases purificadas com os inibidores por ensaios enzimáticos e calorimetria de titulação isotérmica, bem como a avaliação da afinidade e estabilidade dos complexos por métodos espectroscópicos.
Metodologia
Abordagem teórica: simulação por docking molecular; dinâmica molecular e métodos híbridos QM/MM dos complexos formados; estrutura eletrônica dos átomos envolvidos na formação dos complexos; análise da estabilidade molecular dos complexos.
Abordagem experimental: purificação de proteínas e peptídeos; expressão do gene sintético em Escherichia coli; purificação da proteína recombinante; análise da pureza das proteínas e dos peptídeos por espectrometria de massa; ensaio de atividade inibitória por ensaios enzimáticos e por microcalorimetria de titulação isotérmica; estabilidade dos complexos por fluorescência e dicroísmo circular; ensaios de atividade inibitória do BTCI e peptídeos derivados contra as proteases;
Resultados Esperados
A motivação deste projeto foi mediada pelas seguintes considerações e conhecimento prévio da ação do inibidor BTCI, tais sejam: 1) o BTCI é um inibidor do tipo Bowman-Birk que inibe simultaneamente as proteases tripsina e quimotripsina; 2) este inibidor tem sido alvo de estudos há mais de 40 anos, sob o ponto de vista estrutural e funcional, tendo sido caracterizado como potente agente anticarcinogênico contra câncer de mama, como agente anti-hipertensivo e cardiovascular, agente protetor da proteólise quimotríptica do peptídeo guanilina em sistema renal in vivo; 3) apresentou efeito contra o desenvolvimento de larvas e insetos adultos do inseto causador da praga do algodoeiro (Anthonomus grandis); 4) o BTCI inibiu a atividade enzimática da serinoprotease TMPRSS2 (artigo em preparação); 5) a similaridade do domínio catalítico da proteína 3CLpro do tipo quimotripsina-like indica que o BTCI tem potencial para inibir esta protease.
Considerando que os peptídeos derivados do BTCI apresentam características estruturais da região reativa do inibidor, e que este BTCI inibiu a serinoprotease TMPRSS2, espera-se que os peptídeos derivados apresentem inibição similar. A caracterização da afinidade destas moléculas, enzimas e inibidores, bem a inibição indireta da ativação proteolítica da proteína S do vírus, por meio de abordagens experimentais e teóricas, serão fundamentais para descrever o potencial deste inibidor e peptídeos derivados como uma estratégia para prevenção da infecção viral.
Área de Conhecimento
Subárea de Conhecimento
Há previsão de Orçamento proveniente na unidade acadêmica?
Não
Cronograma da Execução
Primeiro ano:
1) Docking molecular da protease principal 3CLpro (PDB code 6LU7) com o inibidor de proteases BTCI (PDB code 3RU4) e com seus peptídeos derivados, PepTry e PepChy.
2) Estudo de estrutura eletrônica do inibidor de proteases BTCI, seus peptídeos, PepTry e PepChy, e dos fármacos cloroquina, hidroxicloroquina, leflunomida, metotrexato e sulfasalazina.
3) Otimização dos complexos formados por dinâmica molecular e análise das interfaces de interação.
4) Obtenção e otimização do modelo tridimensional da proteína TMPRSS2 com base em estruturas cristalográficas com homologia superior a 50%.
5) Docking molecular do modelo 3D da TMPRSS2 com o inibidor BTCI e peptídeos derivados, PepTry e PepChy. Análise da interface e identificação dos aminoácidos envolvidos na estabilização dos complexos.
6) Expressão e purificação da proteína TMPRSS2, e obtenção dos complexos desta proteína com o BTCI e peptídeos derivados, PepTry e PepChy. Determinação das constantes de ligação e dos parâmetros termodinâmicos que caracterizem a afinidade e estabilidade dos complexos formados.
Segundo ano:
1) Obtenção da proteína S e a protease principal 3CLpro do coronavirus SARS-CoV-2 por empresas que comercializam reagentes específicos, ou
2) Desenho y compra dos genes sintéticos da proteína S e a protease principal 3CLpro do coronavirus SARS-CoV-2 para sua expressão em E. coli.
3) Expressão e purificação das proteínas para a realização dos ensaios de caracterização estrutural e enzimática dos complexos com o BTCI e peptídeos derivados, PepTry e PepChy.
4) Dinâmica molecular clássica e QM/MM da protease principal 3CLpro (PDB code 6LU7) com o inibidor de proteases BTCI (PDB code 3RU4) e com seus peptídeos derivados, PepTry e PepChy.
Tempo total de execução previsto
30
