Método de diagnóstico para SARS-CoV-2 baseado em Ribozimas e DNA beacon

Sumário Executivo da Proposta

A presente proposta tem como objetivo o desenvolvimento de método rápido, de custo reduzido e de fácil detecção para diagnóstico de SARS-CoV-2. O método é composto por amostragem de fluidos das vias aéreas superiores, extração do RNA, reação e detecção de fluorescência. A estratégia de reação e detecção baseada em três etapas principais. A primeira consiste no reconhecimento da molécula de RNA viral por duas ribozimas do tipo hammerhead. As regiões alvo de atuação de cada uma das duas ribozimas serão sequências conservadas e específicas do SARS-CoV-2 obtidas após alinhamento genômico das diferentes linhagens viral depositadas em banco de dados específico e comparações com material genético de outros vírus SARS e humanos. Este reconhecimento levará à quebra da molécula de RNA viral e obtenção de um fragmento chamado de iniciador de sinal. A segunda etapa consiste na ligação da molécula iniciadora a um DNA beacon repórter, que possui uma estrutura em forma de grampo tendo em uma das extremidades um fluoróforo e na outra uma molécula quencher. Quando o DNA beacon se encontra na forma de grampo o fluoróforo não emite fluorescência, entretanto quando esta molécula interage com o fragmento iniciador ocorre a abertura do grampo, distanciando o quencher do fluoróforo e nesta configuração molecular permitirá a perda do efeito quenching resultando em fluorescência desse DNA repórter. A terceira etapa prevê o aumento da fluorescência estequiométrica 1:1 pela indução de uma cascata de DNA beacons, de forma que o sinal aumentará em consequência da fluorescência de várias moléculas repórteres multiplexadas.