Informações
Nível de aprovação pela UnB
Aprovado pela UnB
Nome Completo do Proponente
Bergmann Morais Ribeiro
Matrícula UnB
137448
Unidade acadêmica da UnB
bergmann.ribeiro@gmail.com
Link Cúrriculo Lattes
Título da Proposta
Geração de insumos biotecnológicos utilizando diferentes sistemas de expressão de proteínas para a geração de kits de diagnóstico de SARS-CoV-2
Sumário Executivo da Proposta
Este projeto de pesquisa visa produzir antígenos virais de SARS-CoV-2 voltados à formulação de kits de detecção rápido para COVID-19 via detecção do vírus direto da amostra de swab nasal ou oral ou com a detecção de IgM/IgG específico ao vírus utilizando amostra de soro. Serão utilizados diferentes sistemas de expressão de proteínas recombinantes usando bactérias, células de inseto e plantas para produção dos antígenos que serão purificados e submetidos a testes de validação utillizando amostras de indivíduos confirmados para SARS-CoV-2. Estes antígenos são insumos essenciais no desenvolvimento de métodos de detecção rápida do vírus em atual dispersão pela população brasileira e poderão ser utilizados por demais laboratórios no desenvolvimento estratégico de novas soluções no combate à COVID-19.
Tipo da Proposta
Palavras-chave
diagnóstico, SARS-CoV2, biotechnologia, expressão heteróloga, imunodiagnóstico rápido
Número de Integrantes da Equipe
14
Nome dos Integrantes da UnB
Bergmann Morais Ribeiro, Tatsuya Nagata, Jaime Martins de Santana, Márcia Renata Mortari, Izabela M. D. Bastos, Fabricio da Silva Morgado, Leonardo Assis da Silva, Milene Aparecida de Andrade, Diana Praia Borges Freire, Antonio Gomes Ferreira, Ikaro Alves de Andrade, Moana Tavares Lima-Esashika, José Luiz Jivago de Paula Rôlo
Há integrantes externos à UnB?
Sim
Possui apoio de Grupo de Pesquisa Certificado pela UnB no CNPq?
Sim
Nome/Link do Grupo de Pesquisa certificado no CNPq pela UnB
Virologia de Insetos/http://dgp.cnpq.br/dgp/espelhogrupo/7051
Público alvo
Análise do Contexto
A atual pandemia de SARS-CoV-2 que atinge o Brasil está gerando uma grande ansiedade em relação ao número de casos de COVID-19 com grande potencial de sobrecarregar a capacidade do serviço médico no país. O manejo desta epidemia por órgãos responsáveis requer esforços coordenados voltados a detecção da dispersão do vírus na população e futuras ações de vacinação da população ainda não exposta contra o vírus.
A doença COVID-19 causa uma mortalidade variável entre os diferentes países. A mortalidade de aproximadamente 8% foi registrada na Itália, enquanto em Israel, houve registro de apenas 0,3 %. As prováveis razões da baixa mortalidade em Israel estão ligadas à alta capacidade de realização de testes diagnósticos, levando ao tratamento precoce e rastreamento rápido das rotas de infecção. Neste sentido, o Brasil precisa aumentar urgentemente a capacidade de diagnóstico precoce do COVID-19. Para realizar a detecção do vírus, atualmente utiliza-se a técnica de PCR em tempo real utilizando o RNA viral de SARS-CoV-2 como alvo que basicamente detecta a presença de partículas virais nas vias aéreas e boca. O método é extremamente sensível, mas requer insumos, equipamentos e know how que são incomuns no Brasil. Os insumos por sua vez são primariamente produzidos em empresas multinacionais sem residência no país com custos exorbitantes e associados a moedas internacionais, portanto sujeitos a variações imprevisíveis. A mão de obra requer especializações ainda raras no Brasil, usualmente associadas a empresas de diagnóstico privadas e/ou internacionais. Atualmente, existem poucos kits de diagnóstico funcional contra SARS-CoV-2 em humanos que detecte anticorpos contra o vírus. Com base nesta demanda, este projeto visa desenvolver kits rápidos de diagnose e facilitar a execução de testes de detecção por imunocromatografia e/ou ELISA. A imunocromatografia não exige nenhum equipamento específico e tampouco de treinamento, podendo ser executado em casa para amostras de swab nasal ou bucal. A etapa crítica do processo é a produção de antígenos e anticorpos, após o qual o escalonamento da produção de kit não é complexo. Para produção dos antígenos, utilizaremos diferentes sistemas de expressão (bactérias, células de inseto e plantas) para gerar antígenos de boa qualidade.
Breve Fundamentação Teórica
Atualmente, a detecção do SARS-CoV-2 é baseada na técnica molecular RT-qPCR, que requer equipamentos especializados. Em contraste, o diagnóstico baseado em imunocropatografia apresenta as seguintes vantagens quando comparado á técnica de RT-qPCR: (1) não exige nenhum equipamento; (2) é rápido, com o resultado visível em 10 minutos. Esta técnica pode ser dirigida para detecção de dois alvos totalmente diferentes. O primeiro alvo é o anticorpo IgM/IgG de paciente infectado com o SARS-CoV-2. O segundo alvo é o vírus propriamente dito. Em ambos os casos, o antígeno ou o anticorpo preparado será fixado em uma fita de nitrocelulose. Utilizaremos as proteínas sabidamente imunogênicas (N e S) dos diferentes coronavirus conhecidos para a expressão em sistema heterólogo. Evidências experimentais e epidemiológicas relataram a imunodominância em humanos contra parte das proteínas S e N dos diferentes coronavirus, o que as torna um excelente alvo para a geração de kits de detecção do vírus.
Objetivos e Metas
Objetivo
Produção de antígenos virais de diferentes proteínas (N e S) do SARS-CoV-2 para geração de kits de diagnóstico.
Metas
1. Montagem dos vetores para a expressão das proteína N (nucleocapsídeo) e S (superfície do envelope viral, Spike ) de SARS-COV-2;
2. Produção das proteínas recombinantes pelos sistemas de expressão baseados em bactérias, baculovírus e células de inseto e plantas;
3. Purificação dos antígenos por cromatografia;
4. Imunização em coelho e purificação de anticorpos
5. Montagem das fitas de imunocromatografia com a aplicação dos antígenos ou dos anticorpos específicos.
6. Testes de validação no Bio-Manguinhos da Fiocruz via método de ELISA e fita de imunocromatografia.
Metodologia
Os genes N e S do SARS-CoV2 serão sintetizados quimicamente ou amplificados por PCR e clonados em vetores de expressão para bactérias (plasmídeos), células de insetos (baculovírus) e plantas (pepper ringspot virus, PepRSV). Esses vetores, por sua vez, serão utilizados para produção das proteínas recombinantes nas diferentes células. Após a confirmação da expressão das proteínas por SDS-PAGE e Western-blot, a sua expressão será otimizada e as proteínas purificadas por cromatografia. As proteínas serão, então, utilizadas nos testes imunológicos de imunocromatografia e ELISA utilizando soro de pacientes previamente confirmados para infecção com testes moleculares ou amostras derivadas de animais.
Resultados Esperados
Espera-se obter antígenos e anticorpos de alta qualidade propiciando a produção de fitas de imunocromatografia de alta sensibilidade e especificidade, estes kits de detecção serão produzidos em grande escala. A distribuição destes kits diagnósticos rápidos para a comunidade utilizando a rede conectada à Fiocruz/Bio-Manguinhos e outras redes públicas de saúde. O risco do projeto reside na possibilidade de produção de antígenos ou anticorpos de baixa reatividade, inviabilizando a produção de kits de diagnose sensível. Espera-se obter antígenos virais com conformações adequadas e funcionais para a geração de kits de detecção de SARS-CoV-2 em seres humanos e em animais silvestres ou domésticos. Também espera-se que estes antígenos possam ser sujeitos, no futuro, a testes imunológicos pelo menos em camundongos, como potenciais antígenos para geração de vacinas em humanos.
Área de Conhecimento
Subárea de Conhecimento
Cronograma da Execução
Metas Meses Conclusão
1 1º ao 12º 12º
2 1º ao 18º 18º
3 6º ao 18º 18º
4 6º ao 18º 18º
5 12º ao 24º 24º
6 12º ao 24º 24º
Tempo total de execução previsto
24
