Informações
Nível de aprovação pela UnB
Aprovado pela UnB
Nome Completo do Proponente
Renato de Oliveira Resende
Matrícula UnB
137936
Unidade acadêmica da UnB
rresende@unb.br
Link Cúrriculo Lattes
Título da Proposta
Diversidade genômica de coronavirus associada à indução de memória imunológica de curta e média duração: Uma estratégia para a produção de vacinas eficientes e de amplo espectro
Sumário Executivo da Proposta
Este projeto de pesquisa visa monitorar a diversidade diversidade genética do vírus SARS-CoV-2 circulantes no DF em tempo real por meio do sequenciamento de um grande número de amostras. Este monitoramento permitirá (i) identificar os padrões de disseminação geográfica viral, (ii) a identificação de cadeias de transmissão, (iii) a correlação de variantes genéticas com parâmetros clínicos dos pacientes, (iv) correlação de variantes genéticas com a capacidade dos linfócitos T CD4+ dos pacientes em reconhecer os epítopos conservados e/ou específicos do vírus e/ou seus variantes. Todas estas informações são relevantes na implementação e avaliação de estratégias de controle da epidemia a curto, médio e longo prazo.
Os dados genômicos, de ao menos 100 amostras virais representativas do DF, serão integrados com informações clínicas, imunológicas e epidemiológicas para a compreensão dos padrões de dispersão espaço-temporal do vírus e na identificação de regiões do genoma viral envolvidas na interação vírus-hospedeiro. A partir destes dados, será realizada a predição in silico da interação das regiões conservadas e/ou mutadas das proteínas dos vírus com o Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC) de classe I e/ou II utilizando as plataformas Immune Epitope Database (IEDB) e Proped e a síntese dos peptídeos mais promissores. Serão coletadas células do sangue periférico dos pacientes em três momentos distintos do curso da doença: no momento da coleta de material para o diagnóstico, após a alta clínica e um ano após a alta clínica. Os peptídeos sintetizados serão avaliados quanto a sua capacidade de induzir uma resposta de proliferação celular de linfócitos TCD4+ e TCD8+, com análise da expressão de marcadores de ativação bem, como de citocinas secretadas. Usaremos como controle do processo de ativação dos linfócitos T, células obtidas de pacientes em tratamento com imunoterápicos que modulam o processo de ativação destas células. Para acompanhar a resposta do paciente, analisaremos, no soro dos pacientes, os isotipos de IgG, uma vez que esta classe de anticorpos aparecem após 20 dias da exposição do paciente ao vírus e estão relacionados com o processo de ativação dos linfócitos TCD4+. Todos os dados obtidos serão agrupados de acordo com a sintomatologia clínica dos pacientes, em assintomático, sintomas leves, severos ou graves. Os ensaios imunológicos propostos definirão as regiões do vírus que são capazes de estimular os linfócitos T CD4+ e/ou TCD8+ de um grande número de pacientes, definindo os peptídeos candidatos para as estratégias vacinais.
Tipo da Proposta
Palavras-chave
diversidade genética, epidemiologia molecular, filogenômica, memória imunológica, linfócitos T CD4+, linfócitos T CD8+, anticorpos, vacina
Número de Integrantes da Equipe
7
Nome dos Integrantes da UnB
Anamélia Lorenzetti Bocca, Fernando Lucas de Melo, Márcia Renata Mortari, Simone Gonçalves da Fonseca, Gustavo Barra, Romualdo Barroso de Sousa, Stephan Alberto de Oliveira
Há integrantes externos à UnB?
Sim
Possui apoio de Grupo de Pesquisa Certificado pela UnB no CNPq?
Sim
Nome/Link do Grupo de Pesquisa certificado no CNPq pela UnB
Laboratório de Virologia Vegetal, Laboratório de Imunologia Molecular, Patologia dos Processos Inflamatórios, Infecciosos, Neoplásicos e Novas Abordagens Biotecnológicas - UFG, Laboratório Sabin/Unidade de biologia molecular.
Público alvo
Análise do Contexto
A globalização mudou drasticamente a maneira como os patógenos se espalham entre as populações humanas, permitindo que patógenos como o SARS-CoV-2 alcancem uma escala global com potencial devastador. As estratégias epidemiológicas clássicas foram e ainda são, a primeira linha de defesa contra um surto ou epidemia, entretanto, a integração destes métodos com informações sobre a diversidade genética do patógeno é crucial para a compreensão dos padrões de dispersão espacial e temporal, para a identificação de regiões do genoma do patógeno envolvidas na interação com o hospedeiro, no desenvolvimento/implementação de estratégias de controle e na caracterização de respostas à vacinas e tratamentos.
A caracterização genética do patógeno é particularmente importante quando este apresenta taxas de mutação muito mais elevadas do que a do DNA da célula hospedeira, como os vírus de RNA. Estas elevadas taxas de mutação, associadas com as altas taxas de replicação e ao tamanho das populações virais, permitem que os vírus de RNA respondam rapidamente a pressões evolutivas, como por exemplo, as pressões impostas pelo sistema sistema imune do hospedeiro. Esta estratégia do vírus o capacita a evadir da resposta protetora do hospedeiro, aumentando assim, a eficiência da sua disseminação na população.
Considerando a imunidade do hospedeiro frente às infecções virais, os linfócitos TCD4+ possuem um papel central, participando do processo de ativação tanto dos linfócitos TCD8+ como dos linfócitos B, e com o estabelecimento da memória imunológica. Neste contexto, a resposta celular, mediada pelos linfócitos TCD4+, do tipo Th1, é capaz de gerar memória, como descrito em pacientes com Dengue (1). O estabelecimento da memória de longo prazo está correlacionado com a ativação adequada e o repertório de linfócitos gerados.
Considerando o repertório dos linfócitos T, a imunodominância é um conceito que correlaciona a proporção de linfócitos T antígeno específicos selecionados para um determinado peptídeo, em relação ao grupo total destas células que reconhecem os demais fragmentos do antígeno inteiro. A apresentação via Complexo Principal de Histocompatibilidade (denominada HLA em humanos) da proteína viral é um passo importante no processo de seleção dos clones antígeno-específicos e da indução de células de memória. Apesar da sua importância, ainda existem pontos pouco conhecidos da imunodominância da resposta dos linfócitos TCD4+ nas infecções virais e na persistência da memória de longo prazo. Nas infecções causadas pelo vírus da varíola (2), assim como, nas infecções causadas pelo citomegalovírus (3), observa-se uma imunodominância relacionada ao estabelecimento de memória de longo prazo (2). Diante deste cenário, a identificação dos peptídeos capazes de se ligarem no HLA de classe I ou II da população brasileira, é de extrema importância para a predição do estabelecimento de memória imunológica.
Durante a infecção causada pelo SARS-COV-2, já foi descrito que a resposta imune inata possui um importante papel no estabelecimento dos casos mais graves da COVID-19, com aumento da migração de neutrófilo para os pulmões e produção de citocinas pró-inflamatórias além de linfopenia. No entanto, os linfócitos T são células essenciais para o estabelecimento da memória imunológica nestas infecções e para a proteção da reinfecção. A resposta imune inicial observada na COVID-19 é similar às outras duas infecções causadas pelos coronavírus SARS-CoV e MERS-CoV (4, 5). Nas infecções causadas pelo SARS-CoV observou-se uma memória imunológica de até dois anos após a infecção, relacionadas às proteínas estruturais. No entanto, a ativação dos linfócitos TCD4+ não foi tão ampla como a das células TCD8+, e essas células não apresentaram uma imunodominância, resultando em ativação e função policlonais (4, 5). Desta forma, mecanismos que ampliem e direcionem a ativação dos linfócitos TCD4+, para o perfil Th1, podem auxiliar no restabelecimento de pacientes com as formas mais graves da doença e desenvolvimento de estratégias vacinais. Os projetos de vacinas que estão em curso atualmente para a COVID-19 são baseados nos estudos realizados para a SARS e a MERS, utilizando, preferencialmente, proteínas de superfície viral que são conservadas entre os coronavírus (5). A identificação de epítopos mutados do SARS-Cov-2, capazes de gerar uma imunodominância, pode resultar em estratégias mais eficientes de imunização da população, impedindo que ocorram casos de reinfecção de pacientes.
Referencias Bibliográficas
1- Sierra et al. Long-term memory cellular immune response to dengue virus after a natural primary infection. Int. J. Infect Dis., 2002, 6(2): 125-8
2- Jing et al. CD4 T-Cell Memory Responses to Viral Infections of Humans Show Pronounced Immunodominance Independent of Duration or Viral Persistence. J. Virol 2013, 87(5): 2617-2627
3- Sylwester et al. Broadly targeted human cytomegalovirus-specific CD4+ and CD8+ T cells dominate the memory compartments of exposed subjects. J Exp Med. 2005, 202(5):673-85.
4- Prompetchara et al. Immune response in COVID-19 and potential vaccines: Lessons learned from SARS and MERS epidemic. Asian Pac J. Allergy Immunol. 2020, 38(1):1-9
5- Li et al. Coronavirus infections and immune responses. Microbes Infect. 2020, 22(2): 72-73.
Breve Fundamentação Teórica
A Covid-19 é uma doença ainda desconhecida e com impactos imprevisíveis na saúde pública. Até o momento, o Distrito Federal apresenta 238 casos confirmados e 1 morte, com prognóstico de aumento exponencial desses números. Neste contexto, o sequenciamento massivo de genomas virais é essencial para o monitoramento do padrão de espalhamento, da identificação de cadeias de transmissão e também para o monitoramento de mutações fixadas na população viral e o impacto destas nas características biológicas do vírus e na resposta dos hospedeiros à infecção. Devido a gravidade da doença, entender os mecanismos de interação entre o hospedeiro-vírus bem como, à ativação do sistema imunológico do hospedeiro, permitem o desenho racional de estratégias para gerar memória de longa duração nos pacientes, evitando assim, a evasão do vírus ou a modulação negativa da resposta imune protetora protetoras dos pacientes.
Objetivos e Metas
Objetivos
O objetivo deste projeto é monitorar a diversidade genética de SARS-CoV-2 no Distrito Federal, identificar padrões de distribuição espaço-temporal e correlacionar a diversidade genética viral com o estabelecimento de memória imunológica dos pacientes, de curto e médio prazo.
Metas
1. Obtenção de amostras de SARS-CoV-2 de diferentes regiões do Distrito Federal;
A parceria com Instituições/Empresas que realizam os exames de diagnóstico desta doença permitirá que tenhamos acesso às amostras dos pacientes de diferentes regiões
2. Sequenciamento do genoma completo de 100-150 amostras;
O protocolo de sequenciamento genômico de SARS-Cov-2 já foi padronizado em nosso laboratório em parceria com o Laboratório Sabin.
3. Identificação dos padrões de filogenéticos e de disseminação espaço-temporal de SARS-CoV-2;
Serão realizadas reconstruções filogenéticas, estimativas de taxas de substituição, tempos de coalescência (TMRCA), e as taxas de dispersão das diferentes linhagens.
4. Identificação de variantes virais frequentes na população e correlação com parâmetros clínicos;
O monitoramento de variantes e/ou linhagens mais ou menos patogênicas será realizado pelo método de contrastes filogenéticos independentes
5. Coleta de sangue total dos pacientes em três momentos distintos: no momento da coleta de material para o diagnóstico; no momento da alta clínica e 01 ano após a alta clínica;
A primeira amostra será obtida no momento da coleta do material para o diagnóstico, após a assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE). A segunda amostra será obtida na residência ou no hospital onde o paciente se encontrar. A terceira amostra será obtida na residência do paciente. As amostras dos pacientes que tiverem diagnóstico negativo serão utilizados como controle negativo nos ensaios.
6. Análise in sílico dos peptídeos originados das proteínas virais do Covid-19 (dos diferentes genótipos) que se ligam ao HLA de classe I e II da maior parte dos brasileiros e síntese destes peptídeos;
A predição in silico da interação das regiões conservadas e/ou mutadas das proteínas dos vírus com o Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC) de classe I e/ou II será realizada pelas plataformas Immune Epitope Database (IEDB) e Proped. Esta estratégia visa selecionar os peptídeos que serão capazes de interagir com o maior número de moléculas de HLA disponíveis nos programas. A síntese dos peptídeos será realizada por empresa especializada.
7. Análise do perfil de ativação dos linfócitos T CD4+ e TCD8+ dos pacientes nos três momentos da coleta estimulados com os peptídeos escolhidos;
A capacidade dos peptídeos de ativar linfócitos TCD4+ e TCD8+ será avaliada pela expressão das moléculas de ativação CD38 e CD69 e de inibição como CTLA-A4 e PD-1 por citometria de fluxo. A capacidade de proliferação celular será determinada por CFSE em citometria de fluxo.
8. Análise do perfil de citocinas produzidas pelas populações de linfócitos TCD4+ e TCD8+ após a estimulação com os peptídeos escolhidos;
Após a estimulação das células com os peptídeos o perfil de citocinas como IL-2, IFN-gama, TNF-alfa, IL-17, IL-4 nas diferentes subpopulações de memória dos linfócitos será realizado por citometria de fluxo. As células T de memória serão caracterizadas como células T de memória central (CD45RA-CCR7+CD27+) e T de memória efetora (CD45RA-CCR7- CD27-). Alternativamente, será avaliado o perfil de citocinas nos sobrenadantes das culturas por kit multiplex contendo várias citocinas (inflamatórias e reguladoras).
9. Análise do perfil de ativação dos linfócitos T CD4+ e TCD8+ dos pacientes que estão em tratamento com imunoterápicos que modulam a ativação dos linfócitos T, com os peptídeos escolhidos;
A capacidade dos peptídeos de induzirem a ativação dos linfócitos T será também avaliada com a utilização de células obtidas de pacientes tratadas com anticorpos anti- PD-1/PDL-1, conhecidos como inibidores de check-points. Este dado permitirá avaliar se as imunterapias aumentam a susceptibilidade ou não dos pacientes.
10. Análise do perfil dos isótipos dos anticorpos IgG presente no soro dos pacientes.
Os sorotipos da classe IgG presente no soro dos pacientes será determinado por kits comerciais já disponibilizados.
Metodologia
As amostras de SARS-CoV-2 serão sequenciadas de acordo com o protocolo da rede ARTIC em equipamento portátil. Os genomas serão analisados por diferentes técnicas filogenéticas e filogenômicas. Todas as técnicas de sequenciamento e análise já estão estabelecidas em nosso grupo de pesquisa. Os epitopos das proteínas dos vírus serão selecionados a partir da predição de ligação às moléculas de HLA de classe II e I mais frequentes na população, utilizando ferramentas de imuno-informática. As PBMC serão estimuladas com os peptídeos e serão avaliadas a produção de citocinas, proliferação, perfil de ativação e memória imunológica por citometria de fluxo.
Resultados Esperados
(i) Implementação de uma plataforma de sequenciamento rápida que permita, em tempo real, a geração de informação genômica em larga escala para avaliação da dinâmica de disseminação de SARS-Cov-2 no Distrito Federal e da ocorrência de mutantes com propriedades biológicas alteradas;
(ii) Boletins com resultados parciais do projeto para os envolvidos na gestão da epidemia da Secretaria de Saude-DF;
(iii) Obtenção de epitopos obtidos das proteínas do vírus a partir da predição de ligação às moléculas do HLA de classe II e classe I;
(iv) Análise da resposta imunológica dos pacientes em três momentos distintos do curso da doença dos pacientes do DF, com definição do perfil de memória central e efetora dos linfócitos TCD4+;
(v) Definição de epítopo(s) que seja(m) candidatos para o desenvolvimento de uma vacina efetiva e de amplo espectro para esta doença;
(vi) Publicação de artigos científicos na área, aumentando o conhecimento da interação vírus-hospedeiro;
(vii) Formação de recursos humanos;
(viii) Fortalecimento das interações entre instituições públicas e privadas na área de saúde.
Área de Conhecimento
Subárea de Conhecimento
Há previsão de Orçamento proveniente na unidade acadêmica?
Não
Cronograma da Execução
Meta 1- Será realizada do 1º ao 6 º mês
Meta 2- Será realizada do 1º ao 6 º mês
Meta 3- Será realizada do 1º ao 12º mês
Meta 4- Será realizada do 6º ao 12 º mês
Meta 5- Será realizada do 1º ao 20 º mês
Meta 6 – Será realizada do 3 º ao 6 º mês
Meta 7 - Será realizada do 6 º ao 22 º mês
Meta 8 - Será realizada do 6 º ao 24 º mês
Meta 9 - Será realizada do 2 º ao 24 º mês
Meta 10 - Será realizada do 12 º ao 24 º mês
Tempo total de execução previsto
24
