Informações
Nível de aprovação pela UnB
Aprovado pela UnB
Nome Completo do Proponente
ANDREA QUEIROZ MARANHAO
Matrícula UnB
148849
Unidade acadêmica da UnB
andreaqm@unb.br
Link Cúrriculo Lattes
Título da Proposta
Análise de variabilidade e funcionalidade de genoma de SARS-CoV-2 circulantes no DF
Sumário Executivo da Proposta
Esse projeto tem como principais metas: (i) a obtenção dos genomas circulantes no Distrito Federal (DF); (ii) caracterizar as mutações associadas ao domínio de ligação ao recepetor celular ACE2 e aos antígenos de superfície do SARS-CoV-2, e (iii) identificar variantes e sintetizar peptídeos do SARS-CoV-2 que possuam capacidade de se ligar ao receptor ACE2 e que possam ser reconhecidos por anticorpos monoclonais já disponíveis.
Para isso, a partir de dados obtidos de sequencias já disponíveis serão primeiramente sintetizados os peptídeos equivalentes as regiões que o SARS-CoV-2 utiliza para entrar na célula hospedeira, os quais serão testados em ensaios funcionais para a ligação ao receptor ACE2, bem como quanto ao seu reconhecimento pelos anticorpos monoclonais anti-SARS já disponíveis no mercado. Paralelamente, será realizado o sequenciamento de isolados do SARS-CoV-2 circulantes no DF, o que nos permitirá avaliar o grau de infectividade e de imunogenicidade dos variantes de SARS-CoV-2 circulantes Distrito Federal (DF).
Desta forma, o presente projeto visa gerar dados que permitirão a caracterização do genoma do SARS-CoV-2 que está circulando no DF, bem como a identificação de alvos farmacológicos que poderão ser utilizados em terapias anti-virais e de imunização contra o SARS-CoV-2.
Tipo da Proposta
Palavras-chave
SARS-CoV-2, Imunogenicidade, ACE2, Sequenciamento
Número de Integrantes da Equipe
10
Nome dos Integrantes da UnB
Andrea Queiroz Maranhão, Kelly Grace Magalhaes, Georgios Pappas Jr, Jacyelle Medeiros, Renato Kaylan França, Raquel das Neves Almeida, Rafael Corrêa, Gabriel Pasquarelli do Nascimento, Igor de Oliveira Santos, Heloisa Antoniella Braz de Melo
Há integrantes externos à UnB?
Não
Possui apoio de Grupo de Pesquisa Certificado pela UnB no CNPq?
Não
Público alvo
Análise do Contexto
A recente pandemia de COVID-19 impõe respostas rápidas da comunidade científica no sentido de compreender a sua dinâmica intrinsecamente relacionada à resposta imune dos infectados, bem como a capacidade de infecção e escape do seu agente etiológico, o SARS-CoV-2. Esses dois aspectos estão relacionados à capacidade de mutação do vírus, particularmente as que dizem respeito à variação dos antígenos de superfície e dos motivos proteicos relacionados ao seu ciclo replicativo.
O SARS-CoV-2 é um corona vírus do gênero Betacoronavirus, a mesma linhagem do SARS-CoV, que causou em 2002 um surto da síndrome respiratória aguda grave, SARS em inglês (FUNG; LIU, 2019). Os Betacoronavirus possuem genomas de RNA fita simples positiva com aproximadamente 30 mil bases, codificando proteínas estruturais denominadas S (do inglês spike), M (membrana), E (de envelope) e N (de Nucleocapsídeo) (STADLER et al., 2003). A proteína S é aquela responsável pela ligação do vírion com o receptor da célula hospedeira, além de conter motivos proteicos que sofrem mudanças conformacionais que possibilitam a fusão do envelope viral com as membranas da célula hospedeira (Fusion Loop). Essa região do genoma tem cerca de 8.000 bases e, além das proteínas estruturais, é predita a existência de algumas ORFs não-estruturais, de função ainda não muito clara, denominadas coletivamente como proteínas acessórias (JIA, 2016).
Para que o SARS-CoV-2 possa se replicar, ele precisa entrar na célula hospedeira e utilizar sua maquinaria de síntese proteica. Para isso, SARS-CoV-2 se liga a receptores específicos na célula hospedeira, por meio da ligação da sua proteína viral Spike à enzima conversora de angiotensina 2 (do inglês, Angiotensin Converting Enzyme 2 – ACE2), a qual está presente em em vários tipos celulares, incluindo células pulmonares. Até o presente momento, ACE2 é reconhecida como a principal molécula receptora que permite a entrada do SARS-CoV-2 na célula hospedeira (HOFFMANN et al., 2020; YAN et al., 2020).
Estudos recentes realizados em isolados de pacientes de COVID-19 mostram que mesmo dentro de um mesmo indivíduo ocorrem mutações ao longo de todo o genoma viral, sendo essas predominantes em cinco genes: S (proteína de superfície), N (proteína do nucleocapsídio) e nas ORFS 8, 3a e 1ab (SHEN et al., 2020; ZHAO et al., 2020). A existência dessas mutações sugere que o vírus iniciou a sua adaptação ao hospedeiro humano, incluindo mutações na região do domínio de ligação ao receptor ACE (Região RDB) que podem resultar em um aumento da afinidade, resultando num aumento da infectividade (ANDERSEN et al., 2020; OU et al., 2020; WRAPP et al., 2020) e diferenças em sua antigenicidade (WANG et al., 2020).
Neste contexto, esse projeto pretende explorar essas duas características tendo como principais metas: (i) a obtenção dos genomas circulantes no Distrito Federal (DF); (ii) caracterizar as mutações associadas ao RDB e aos antígenos de superfície do SARS-CoV-2, e (iii) identificar variantes e sintetizar peptídeos do SARS-CoV-2 que possuam capacidade de se ligar ao receptor ACE2 e que possam ser reconhecidos por anticorpos monoclonais já disponíveis.
Para isso, serão primeiramente sintetizados os peptídeos equivalentes as regiões que o SARS-CoV-2 utiliza para entrar na célula hospedeira, os quais serão testados em ensaios funcionais para a ligação ao receptor ACE2, bem como quanto ao seu reconhecimento pelos anticorpos monoclonais anti-SARS já disponíveis no mercado. Paralelamente, será realizado o sequenciamento de isolados do SARS-CoV-2 circulantes no DF, o que nos permitirá avaliar o grau de infectividade e de imunogenicidade dos variantes de SARS-CoV-2 circulantes Distrito Federal (DF).
Desta forma, o presente projeto visa gerar dados que permitirão a caracterização do genoma do SARS-CoV-2 que está circulando no DF, bem como a identificação de alvos farmacológicos que poderão ser utilizados em terapias anti-virais e de imunização contra o SARS-CoV-2.
REFERENCIAS:
ANDERSEN, K. G. et al. The proximal origin of SARS-CoV-2. Nature Medicine, 17 mar. 2020.
FUNG, T. S.; LIU, D. X. Human Coronavirus: Host-Pathogen Interaction. Annual Review of Microbiology, v. 73, p. 529–557, 08 2019.
HOFFMANN, M. et al. SARS-CoV-2 Cell Entry Depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is Blocked by a Clinically Proven Protease Inhibitor. Cell, 4 mar. 2020.
JIA, H. Pulmonary Angiotensin-Converting Enzyme 2 (ACE2) and Inflammatory Lung Disease. Shock (Augusta, Ga.), v. 46, n. 3, p. 239–248, 2016.
OU, J. et al. RBD mutations from circulating SARS-CoV-2 strains enhance the structural stability and human ACE2 affinity of the spike protein. bioRxiv, p. 2020.03.15.991844, 1 jan. 2020.
SHEN, Z. et al. Genomic diversity of SARS-CoV-2 in Coronavirus Disease 2019 patients. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America, 4 mar. 2020.
STADLER, K. et al. SARS--beginning to understand a new virus. Nature Reviews. Microbiology, v. 1, n. 3, p. 209–218, dez. 2003.
WANG, C. et al. A human monoclonal antibody blocking SARS-CoV-2 infection. bioRxiv, p. 2020.03.11.987958, 1 jan. 2020.
WRAPP, D. et al. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science (New York, N.Y.), v. 367, n. 6483, p. 1260–1263, 13 2020.
YAN, R. et al. Structural basis for the recognition of SARS-CoV-2 by full-length human ACE2. Science (New York, N.Y.), v. 367, n. 6485, p. 1444–1448, 27 mar. 2020.
ZHAO, W.-M. et al. The 2019 novel coronavirus resource. Yi Chuan = Hereditas, v. 42, n. 2, p. 212–221, 20 fev. 2020.
Breve Fundamentação Teórica
Estudos recentes realizados em isolados de pacientes de COVID-19 mostram que mesmo dentro de um mesmo indivíduo ocorrem mutações ao longo de todo o genoma viral, sendo essas predominantes em cinco genes: S (proteína de superfície), N (proteína do nucleocapsídio) e em outras ORFs. A existência dessas mutações sugere que o vírus iniciou a sua adaptação ao hospedeiro humano, incluindo mutações na região do domínio de ligação ao receptor ACE (Região RDB) que podem resultar em um aumento da afinidade, além de interferir na infectividade e em sua antigenicidade. São Objetivos desta proposta: Sequenciar o genoma dos vírus SARS-CoV-2 circulantes no DF; testar, a partir dos da análise dos genomas de SARS-CoV-2 disponíveis e aqueles obtidos no DF epítopos diferenciais entre SARS-CoV- 1 e 2 e domínios ligantes a ACE2 já conhecidos e aqueles circulantes no DF.
Objetivos e Metas
Objetivos
1- Realizar massivamente o sequenciamento do genoma dos vírus SARS-CoV-2 circulantes no DF;
2- Propor e testar, a partir dos da análise dos genomas de SARS-CoV-2 disponíveis e aqueles obtidos no DF epítopos diferenciais entre SARS-CoV- 1 e 2;
3- Propor e testar, a partir da análise dos genomas de SARS-CoV-2 disponíveis e aqueles obtidos no DF peptídeos capazes de se ligar ao receptor ACE2.
Metodologia
1- Sequenciamento de vírus circulantes no DF utilizando o dispositivo portátil MinION®.
a. Processamento computacional para obtenção das sequências dos isolados virais
b. Análise comparativa das sequências contra genomas de SARS-CoV-2 de outras localidades, disponíveis nos bancos de dados públicos.
2- Análise das sequências para identificar os motivos proteicos para a síntese dos peptídeos ligantes ao receptor ACE2 e aos epítopos imunogênicos;
3- Teste da imunogenicidade de epítopos de SARS-CoV-2 com anticorpos já disponíveis no mercado por western blotting e ELISA
4- Teste funcional de ligação de peptídeos dos diferentes RDBs realizado por meio da técnica de técnica de LBA.
Resultados Esperados
1. Realizar o sequenciamento do genoma viral de isolados do DF;
2. Avaliar o grau de imunogenicidade de diferentes peptídeos em imunoensaios com anticorpos monoclonais anti-SARS já disponíveis no mercado;
3. Avaliar a capacidade de ligação ao receptor ACE2 humano de peptídeos derivados de sequências de SARS-CoV-2 que permitirá a identificação de alvos farmacológicos que poderão ser utilizados em terapias anti-virais e de imunização contra o SARS-CoV-2;
4. A partir da análise do genoma dos vírus circulantes no DF e dos dados obtidos nos ensaios funcionais iremos realizar a análise do grau de variabilidade destes, com inferências na imunogenicidade e infectividade, bem como na capacidade de imunização passiva da população do DF.
Área de Conhecimento
Subárea de Conhecimento
Há previsão de Orçamento proveniente na unidade acadêmica?
Não
Cronograma da Execução
Atividade
Aquisição de kits de sequenciamento e insumos (Meses 1 e 2)
Análise de sequencias de genoma disponiveis e obtidos (Meses 1 a 6)
Desenho dos peptídeos (Meses 1 e 2)
Sequenciamento de SARS-CoV-2 circulantes no DF (Meses 3 a 6)
Ensaios de ELISA e Western BLotting (Meses 3a 6)
Ensaios de ligação a ACE2 (Meses 3a 6)
Tempo total de execução previsto
6
