Informações
Nível de aprovação pela UnB
Aprovado pela UnB
Nome Completo do Proponente
Lidia Maria Pepe de Moraes
Matrícula UnB
152277
Unidade acadêmica da UnB
lmoraes@unb.br
Link Cúrriculo Lattes
http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781651H9
Título da Proposta
Produção de enzimas para diagnóstico de CoVid-19
Sumário Executivo da Proposta
Plasmidios produtores de Transcriptase Reversa e TaqDNA Polimerase recombinantes, ambos já disponíveis
1 - Transformação em linhagem apropriada de E. Coli.
2 - Seleção de clones Produtores das enzimas
3 - Ajuste das condições de produção das enzimas
4 - Purificação e análise da atividade enzimatica.
5 – Definição das condições das reações
6 – Controle de qualidade das enzimas
7 - Escalonamento
Tipo da Proposta
Palavras-chave
Transcriptase reversa recombinante, TaqDNA Polimerase recombinante, E. coli, produção, purificação, escalonamento
Número de Integrantes da Equipe
4
Nome dos Integrantes da UnB
Eliane Ferreira Noronha; Fernando Araripe Gonçalves Torres, Janice Lisboa de Marco
Há integrantes externos à UnB?
Sim
Possui apoio de Grupo de Pesquisa Certificado pela UnB no CNPq?
Sim
Nome/Link do Grupo de Pesquisa certificado no CNPq pela UnB
Público alvo
Análise do Contexto
Aumento da capacidade de diagnosticar indivíduos saudáveis, portadores e infectados com o CoVid-19
Breve Fundamentação Teórica
Os coronavírus representam um grupo de vírus cujos genomas são baseados em RNA fita simples de sentido positivo (+)ssRNA sendo causadores de diversas infecções respiratórias em humanos, incluindo a COVID-19. O diagnóstico rápido e preciso deste vírus é fundamental para nortear o tratamento da doença. Atualmente, os mais importantes testes de diagnóstico deste vírus são baseadas em imunoensaios (ELISA) ou em testes moleculares (PCR). Por se tratar de um genoma de RNA, a detecção do coronavírus se dá pela RT-PCR que envolve o isso de duas enzimas: transcriptase reversa e Taq DNA polimerase. Trata-se do padrão ouro para diagnóstico laboratorial da COVID-19 para amostras coletadas no trato respiratório superior ou inferior. Vários kits de RT-PCR foram desenvolvidos desde a eclosão da pandemia. Em nosso laboratório já dispomos de clones bacterianos que produzem essas enzimas em grande quantidade e poderiam ser empregados para desenvolvimento de um kit nacional.
Objetivos e Metas
Produção de Transcriptase Reversa e Taq DNA Polimerase recombinantes
Metas
1 - Seleção de clones e produção das enzimas
2 - Purificação das enzimas recombinantes
3 - Controle de qualidade das enzimas
4 - Escalonamento
Metodologia
Produção e purificação
Pré-inóculo dos clones em meio LB na presença de Ampicilina (100ug/mL). Incubar a 37°C, overnight sob agitação. Recomenda-se colocar o pré-inóculo depois das 16h da tarde. Inocular os clones (1% do volume do meio) em meio LB na presença de Ampicilina (100ug/mL) na proporção volume frasco : volume meio de 500 mL : 100 mL. Acompanhar o crescimento celular das culturas à 600 nm até atingirem absorbância de aproximadamente 0,6 (tanto Taq quanto RT). Após atingir absorbância na faixa esperada, adicionar 1 mM de IPTG para iniciar a indução.
Após indução, recuperar as células por centrifugação (4000 rpm/15 min/4°C). Repetir o procedimento até recuperação total do volume de meio. Descartar o sobrenadando e ressuspender as células em Tampão de ressuspensão apropriado gelado (no caso da RT o tampão deve conter 100 mM de imidazol), 5 mL de solução para cada 50 mL de cultura. Adicionar 1 mM PMSF e 0,5 mg/mL de lisozima. Incubar a mistura no gelo durante 2 horas. Sonicar a amostra em banho de gelo. Centrifugar (4000 rpm/60 min/4°C) e recuperar o sobrenadante e incubar em banho-maria a 75°C/60 min para Taq.
Após, colocar imediatamente no gelo durante 20 min e centrifugar (14000 rpm/60 min/4°C) para remoção de proteínas de E. coli desnaturadas. Coletar o sobrenadante em um único tubo e realizar cromatografia de troca iônica para Taq DNA Polimerase. Para a RT proceder a purificação em coluna de níquel. Analisar o extrato clarificado por SDS-PAGE 12%.
Quantificação da atividade enzimatica
A atividade de Taq DNA Polimerase é definida como a quantidade de enzima necessária para incorporar 10 nmol de dNTPs em material ácido-insolúvel (DNA) em 30 minutos a 75° C. A atividade de Transcriptase Reversa é definida como a quantidade de enzima necessária para incorporar 1 nmol de dNTPs em material ácido-insolúvel (DNA) em 10 minutos a 37° C.
A determinação da atividade da Taq DNA Polimerase será realizada por comparação com enzimas comerciais em reação de PCR quantitativo contendo diferentes quantidades de DNA molde.
A determinação da atividade de transcriptase reversa será feita por reação com diferentes concentrações de RNA total seguida de uma reação de PCR com concentração definida de DNA Polimerase.
Controle de qualidade
Verificar estabilidade e processividade das enzimas, assim como a presença de atividades contaminantes de endonuclease, exonuclease e RNAse.
Escalonamento
Definição das condições de crescimento e indução em frascos de até 1L. A seguir, proceder as definições de crescimento em fermentador de 1 L. Definir agitação, pH ótimo, temperatura e oxigenação. Definir tempo de indução em 1 L. Repassar as condições para fermentador de 10 L.
Resultados Esperados
Produção de Taq DNA Polimerase de boa qualidade para testes de diagnóstico
Produção de Transcriptase Reversa de qualidade para diagnóstico
Área de Conhecimento
Subárea de Conhecimento
Há previsão de Orçamento proveniente na unidade acadêmica?
Não
Cronograma da Execução
1 - Produção e purificação – 4 meses
2 - Quantificação da atividade enzimática – 3 meses
3 – Controle de qualidade – 4 meses
4 – escalonamento – 6 meses
Tempo total de execução previsto
12
